Impianto di menisco collagenico (CMI): analisi ultrastrutturale, biochimica e dell’espressione genica dell’impianto

[Machine translation] Introduction: Collagenic meniscus implantation (CMI) is a tissue engineering technique for treating non-repairable meniscus injuries. This procedure involves the use of a scaffold of type I collagen, derived from the bovine Achilles tendon. The structure is similar to the human meniscus and is enriched in glycosaminoglycans (GAGs) that stimulate cell invasion and proliferation, and therefore tissue regeneration. The purpose of the study is to evaluate the structural and molecular evolution of the CMI after implantation. To define the phenotype of the cells that invade the scaffold, gene expression techniques were used. Material and methods: The study was performed on 5 biopsy samples, taken from 5 different patients at different times: 3 to 7 months, 1 to 12 months and 1 to 18 months. In addition, a scaffold before implantation, a normal human meniscus and an allograft 16 months after implantation were used as a control group. The samples were taken using an 18G Temno device prostate biopsy needle (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL). Light microscopy, immunohistochemistry (collagen type I and II), SEM and TEM techniques were used for the morphological analysis. For the biochemical evaluation, Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) was used, a technique that allows studying the composition of the individual disaccharide units of GAGs, molecules of the extracellular matrix. The analysis of gene expression was performed using Real Time PCR (RT-PCR), a method that highlights the activation of a specific gene during the different polymerization phases. For this purpose, the type I collagen gene and the Versican gene, a proteoglycan specific to meniscus fibrocartilaginous tissue, have been studied. Results: The scaffold is composed of connective sheets parallel to each other, connected by smaller fibers to delimit gaps (fig. 1). The latter result in a porosity that can be appreciated exclusively within the structure. In fact, the surfaces of the CMI are characterized by a dense network of collagenic fibrils that determine a more compact organization. In biopsy samples at 7 months, the lacunae were invaded by connective tissue characterized by the presence of fibroblasts and neovases (fig. 2). The checks at 12 and 18 months showed a greater structural organization of the plant and the appearance of units morphologically similar to chondrons. Comparing these data to those observed in the control group, there was a greater superimposition of the implants to the normal meniscus in terms of number of cells and organization of the extracellular matrix. No signs of tissue necrosis and monocyte-macrophage cell invasion were found. At immunohistochemistry, type I collagen was present in the scaffold, while type II appeared in the newly formed tissue in all controls. FACE did not detect glycosaminoglycans in the scaffold, unlike the plants where the disaccharides were present. The electrophoretic picture was superimposable to that of the normal meniscus. Differences were observed only in the intensity of the different bands. The RT-PCR recorded the expression of both genes considered in the implants as opposed to the scaffold where no signal was appreciated (fig. 3-4). In the allograft, only the activation of the type I collagen gene was observed. Differences in the amount of gene expression were highlighted between the different samples. Conclusions: Morphological observations show that the CMI is a biocompatible structure that stimulates cellular and vascular colonization. The different patterns observed demonstrate the gradual maturation of the implant towards a structural organization similar to a meniscus. The differences in intensity in the different disaccharide bands compared to the control meniscus are due to the intense metabolic activity of the cells that invade the scaffold. This is confirmed by the data obtained with RT-PCR, which also shows a variability in the expression of the same gene in the different samples considered. The small number of samples analyzed and the short follow-up do not allow definitive considerations to be formulated. In the future, further morphological and molecular studies will determine the real effectiveness of CMI in meniscus tissue regeneration. Bibliography: Stone KR, Webber RJ, Rodkey WG, and Steadman JR. Prosthetic meniscal replacement: In vitro studies of meniscal regeneration using copolymeric collagen prostheses. Arthroscopy 1989; 5:152. Stone KR, Steadman JR, Rodkey WG, Li ST. Regeneration of meniscal cartilage with use of a collagen scaffold. Analysis of preliminary data. J Bone Joint Surg Am 1997; 79 (12): 1770-7. Rodkey WG, Steadman JR, Li S-T. A Clinical Study of Collagen Meniscus Implants to restore the injured meniscus. Clin Orthop Rel Res 1999; 367S: S281-S92. Ronga M, Bulgheroni P, Manelli A, Genovese E, Grassi F, Cherubino P. Short-term evaluation of collagen meniscus implants (CMI) by MRI and morphological analysis. J Orthopard Traumatol 2003; 4 (1): 5-10.
Introduzione: L'impianto di menisco collagenico (CMI) è una tecnica di ingegneria tissutale per il trattamento delle lesioni meniscali non riparabili. Tale procedura prevede l’utilizzo di uno scaffold di collagene tipo I, derivato dal tendine Achilleo bovino. La struttura si presenta di forma simile al menisco umano ed è arricchito in glicosaminoglicani (GAGs) che stimolano l’invasione e la proliferazione cellulare, quindi la rigenerazione tissutale. Scopo dello studio è valutare l’evoluzione strutturale e molecolare del CMI dopo l’impianto. Per definire il fenotipo delle cellule che invadono lo scaffold, sono state utilizzate tecniche di espressione genica. Materiale e metodi: Lo studio è stato eseguito su 5 campioni bioptici, prelevati da 5 differenti pazienti a tempi diversi: 3 a 7 mesi, 1 a 12 mesi ed 1 a 18 mesi. Inoltre come gruppo controllo sono stati utilizzati uno scaffold prima dell’impianto, un menisco umano normale ed un allograft a 16 mesi dall’impianto. I campioni sono stati prelevati mediante l’utilizzo di un ago da biopsia prostatica 18G Temno device (Allegiance Healthcare Corp., McGaw Park, IL). Per l’analisi morfologica sono state utilizzate tecniche di microscopia luce, immunoistochimica (collagene tipo I e II), SEM e TEM. Per la valutazione biochimica è stata adoperata la Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE), una tecnica che consente di studiare la composizione delle singole unità disaccaridiche dei GAGs, molecole della matrice extracellulare. L’analisi dell’espressione genica è stata eseguita mediante la Real Time PCR (RT-PCR), una metodica che evidenzia l’attivazione di uno specifico gene durante le diverse fasi di polimerizzazione. Sono stati studiati a tal fine il gene del collagene tipo I ed il gene del versicano, proteoglicano specifico del tessuto fibrocartilagineo meniscale. Risultati: Lo scaffold è composto da lamine connettivali parallele tra loro, connesse da fibre minori a delimitare lacune (fig. 1). Queste ultime determinano una porosità che si apprezza esclusivamente all’interno della struttura. Infatti le superfici del CMI sono caratterizzate da una fitta rete di fibrille collageniche che determinano un’organizzazione più compatta. Nei campioni bioptici a 7 mesi, le lacune erano invase da tessuto connettivo caratterizzato dalla presenza di fibroblasti e neovasi (fig. 2). Nei controlli a 12 e 18 mesi si è osservato una maggiore organizzazione strutturale dell’impianto e la comparsa di unità morfologicamente simili ai condroni. Confrontando tali dati a quelli osservati nel gruppo controllo, si è registrato una maggiore sovrapponibilità degli impianti al menisco normale per numero di cellule ed organizzazione della matrice extracellulare. Non sono stati riscontrati segni di necrosi tissutale ed invasione di cellule monocito-macrofagiche. All’immunoistochimica era presente collagene tipo I nello scaffold, mentre il tipo II appariva nel tessuto neoformato in tutti i controlli. La FACE non ha evidenziato glicosaminoglicani nello scaffold, al contrario degli impianti dove i disaccaridi erano presenti. Il quadro elettroforetico era sovrapponibile a quello del menisco normale. Sono state osservate differenze esclusivamente nell’intensità delle diverse bande. La RT-PCR ha registrato l’espressione di entrambi i geni considerati negli impianti al contrario dello scaffold dove non è stato apprezzato nessun segnale (fig. 3-4). Nell’allograft è stato osservato esclusivamente l’attivazione del gene collagene tipo I. Differenze nella quantità dell’espressione genica sono state evidenziate tra i diversi campioni. Conclusioni: Le osservazioni morfologiche dimostrano che il CMI è una struttura biocompatibile che stimola la colonizzazione cellulare e vascolare. I diversi quadri osservati dimostrano la graduale maturazione dell’impianto verso un’organizzazione strutturale simile ad un menisco. Le differenze di intensità nelle diverse bande dei disaccaridi rispetto al menisco di controllo sono da imputare all’intensa attività metabolica delle cellule che invadono lo scaffold. Ciò è confermato dai dati ottenuti con la RT-PCR che evidenzia inoltre una variabilità nell’espressione di uno stesso gene nei diversi campioni considerati. Il numero esiguo di campioni analizzati ed il breve follow-up non consentono di formulare considerazioni definitive. In futuro, ulteriori studi morfologici e molecolari determineranno la reale efficacia del CMI nella rigenerazione del tessuto meniscale. Bibliografia: Stone KR, Webber RJ, Rodkey WG, and Steadman JR. Prosthetic meniscal replacement: In vitro studies of meniscal regeneration using copolymeric collagen prostheses. Arthroscopy 1989; 5: 152. Stone KR, Steadman JR, Rodkey WG, Li ST. Regeneration of meniscal cartilage with use of a collagen scaffold. Analysis of preliminary data. J Bone Joint Surg Am 1997; 79(12): 1770-7. Rodkey WG, Steadman JR, Li S-T. A Clinical study of Collagen Meniscus Implants to restore the injured meniscus. Clin Orthop Rel Res 1999; 367S: S281-S92. Ronga M, Bulgheroni P, Manelli A, Genovese E, Grassi F, Cherubino P. Short-term evaluation of collagen meniscus implants (CMI) by MRI and morphological analysis. J Orthopaed Traumatol 2003; 4(1): 5-10.