Studi di tossicità di vettori non virali di nuova formulazione

Nella parete dei vasi avvengono processi simili a quanto avviene sia fisiologicamente durante lo sviluppo sia in situazioni patologiche nella ossificazione endocondrale e intramembranosa e la precipitazione del calcio porta ad una architettura scheletrica, istologicamente indistinguibile dalla struttura trabecolare dell'osso. Grazie alla cooperazione ed integrazione delle esperienze cliniche, biologiche, genetiche, chimiche ed ingegneristiche dei Ricercatori partecipanti, ci proponiamo di capire e quindi inibire il meccanismo alla base della calcificazione vascolare che avviene sia nella tonaca intima sia nella tonaca media delle arterie, con modalità non completamente note. Sulla base delle nostre esperienze, relative a: 1) mappatura del microRNA endoteliale durante il processo di differenziamento delle cellule progenitrici; 2) meccanismi responsabili del differenziamento delle cellule sottoposte a stimolazioni meccaniche; 3) meccanismi che regolano l’ossificazione delle cellule vascolari, ci proponiamo di sviluppare nanomateriali funzionalizzati capaci di prevenire, stabilizzare o far regredire la calcificazione dei vasi. Piattaforme di rilascio costituite da nanoparticelle polimeriche con siRNA sono state già sviluppate e testate nel nostro precedente PRIN 2008, e saranno utilizzate (e confrontate) con le nuove nanoparticelle sviluppate in questo progetto utilizzando la tecnica del molecular imprinting e dotate di funzioni sinergiche, incluso il rilascio contemporaneo di diversi fattori. Le nanoparticelle che evidenzieranno maggior efficienza di trasfezione cellulare e maggior capacità di veicolare anticorpi alle cellule bersaglio verranno legate ai siRNA, miRNA o ad anticorpi individuati quali i migliori inibitori dei meccanismi alla base del processo di ossificazione vascolare. Per testare l'attività del nanocostrutto biotecnologico neoformato, useremo modelli aterosclerotici 3D in vitro, usando cellule endoteliali primarie, monociti, cellule dendritiche, osteoblasti, osteoclasti, e cellule muscolari lisce, tutte di origine umana, che saranno messe in coltura in condizioni sia statiche che dinamiche, grazie alla disponibilità di un bioreattore a Novara nel laboratorio di colture dinamiche della Anatomia Umana. Studieremo inoltre l'efficacia in modelli aterosclerotici su colture di organi ex vivo, utilizzando frammenti ottenuti da espianti di arterie calcificate (coronarie e aorta). I risultati ottenuti saranno utilizzati in un sistema terapeutico in grado di prevenire, stabilizzare, o meglio, far regredire la “scheletrizzazione” della parete arteriosa, molto utile per ridurre i frequenti e deleteri eventi cardiovascolari a questa associati. I nostri risultati potranno essere applicati al trattamento delle patologie associate alla "scheletrizzazione" ectopica, come per esempio la calcificazione delle valvole cardiache, la calcificazione di protesi vascolari e stent restenosi. Per esempio, per prevenire la restenosi in-stent, che provoca la frattura dell’innesto e la sua perdita funzionale, nell'ultimo anno del progetto, saranno modificati chimico-fisicamente stent metallici per legare allo stent le nanoparticelle formulate ed inibire la produzione di fattori osteogenici nella sede di impianto. Si ipotizza quindi alla conclusione del progetto di proporre uno stent a rilascio bifasico attivo sulle cellule endoteliali (miRNA o anticorpi) e sulle cellule muscolari lisce (siRNA o anticorpi) come strategia per fornire una nuova generazione di bioprotesi e stent con effetti collaterali minimizzati. Processes similar to endochondral and intramembranous bone formation occur in the vascular wall and calcium precipitation develops a complete skeletal architecture, histologically indistinguishable from trabecular bone. Putting together clinical biological genetic chemical and engineering experiences of the different units forming this Research Group, we should inhibit the mechanisms at the basis of vascular calcification that occurs both in the intimal and in the medial layers of the arteries. On the basis of our experiences on: 1) microRNAs mapping during the differentiation process of progenitor cells; 2) differentiation of cells under mechanichal stimulations; 3) the mechanisms regulating ossification through phenotypic plasticity of vascular cells, we will address and use the experiences of the chemical groups partecipating in the project to develop functionalized nanomaterials able to prevent, stabilize or regress vessels calcification. Polymeric siRNA/nanoparticles delivery platforms have been developed and tested in our previous PRIN 2008 and will be used and compared in this project with new developed molecular imprinted nanoparticles that will have the ability to perform synergic functions including co-delivery of multiple drugs. We will use in vitro 3D atherosclerotic models using primary endothelial cells, monocytes, dendritic cells, osteoblasts, osteoclasts and smooth muscle cells all of human origin that will be cultured in static but also in dynamic conditions thanks to the availability of a bioreactor in Novara. We will study also an ex vivo organ culture atherosclerotic model using surgical explanted fragments of calcified arteries (coronary and aorta). The obtained results will be used to develop a therapeutic system that want to prevent or stabilize or better regress the arterial wall “skeletonization” and prevent chronic in-stent restenosis. For this final part of the project metallic stents will be chemico-phisically modified by a collaboration of the Unit groups involved in this project and an European group. We will obtain a biphasic nanoparticle delivering stents active on endothelial cells on the vessel lumen side, with miRNA release, and on muscle cells on the vessel wall side with siRNA or Antibody release. It may be considered as a strategy to solve these problems and lead to the production of a new generation of active bioprosthesis and stents with minimal side effects.