Nanotecnologie per variare i programmi di sviluppo osseo nella parete vasale per la prevenzione e trattamento delle patologie associate alla calcificazione ectopica arteriosa

Il rapido sviluppo dell’RNA interference (RNAi) ha aperto la strada a nuove e promettenti strategie per la regolazione terapeutica dell’espressione genica (McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet (2002) 3:737-747). Risultati interessanti sono stati ottenuti con “small interfering” RNAs (siRNAs) su modelli animali e molti trial clinici sono in corso (de Fougerolles A, Vornlocher HP, Maraganore J, Lieberman J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov (2007) 6:443-453). Nonostante i promettenti sviluppi, la terapia a base di oligonucleotidi presenta ancora alcuni problemi ed ostacoli da superare. E' importante ricordare che gli oligonucleotidi (a) non permeano la membrana cellulare per semplice diffusione, a causa della natura idrofobica del doppio strato lipidico della membrana; (b) hanno stabilità nel sangue limitata; e (c) possono stimolare, in maniera aspecifica, la risposta immunitaria. Accanto, quindi, alla sintesi di nuovi vettori caratterizzati da una maggiore biocompatibilità e da una maggiore efficienza nel veicolare gli siRNA all’interno della cellula, sono stati proposte nuove soluzione per aumentare la loro concentrazione nel tessuto bersaglio evitando contemporaneamente il loro inoculo nel torrente circolatorio. Piattaforme a rilascio locale facilmente impiantabili caratterizzate da un supporto biodegradabile che intrappola prima e rilascia poi siRNA sono state recentemente proposte. In questo studio proponiamo approcci innovativi per il rilascio di siRNA che vedono l’utilizzo di nanoparticelle coniugate a oligonucleotidi ed intrappolate in una matrice artificiale biodegradabile in modo tale da permettere il rilascio controllato nel sito da trattare. Il nanoparticolato polimerico verrà ottenuto mediante legame di un polimero cationico ad alto peso molecolare e caratterizzato da elevata citotossicità, polietilenimmine, (HMW PEI), con policaprolattone (PCL) o polietilenglicole (PEG)chimicmente modificati. In questo modo, l'alta efficienza di trasfezione del HMW-PEI dovrebbe essere preservata mentre verrebbe ridotta la sua tossicità. Inoltre per aumentare la specificità verso la cellula bersaglio verranno sintetizzati nuovi PEG galattosilati (polimeri idrofilici) mediante l’uso di beta-glicosidasi mutanti ottenuti da Sulfolobus solfataricus. L’aggiunta di molecole specifiche come il galattosio permetterà al complesso siRNA/nanoparticelle di entrare solo nelle cellule che presentano recettori tipo asialoglicoproteina. Per permettere un rilascio locale del coniugato siRNA/nanoparticelle evitando ripetute somministrazioni locali e/o sistemiche, il complesso verrà intrappolato in supporti (scaffold) biodegradabili. Proponiamo come scaffold degli idrogeli biocompatibili e biodegradabili costituiti da due o più polimeri, di cui uno solo risulta essere reticolato (tecnica del ‘Semi-Interpenetrating’; SPINs), tipo alginato/chitosano/ialuronico. Alternativamente, verranno formulati degli SPINs costituiti da polimeri naturali e componenti proteiche della matrice extracellulare (collagene, gelatina e/o acido ialuronico). I coniugati siRNA/nanoparticelle verranno intrappolati negli idrogeli prima della loro reticolazione ed usati come supporti non sintetici per il rilascio locale di siRNA/nanoparticolato. La nuova piattaforma a rilascio di siRNA verrà caratterizzata studiandone le proprietà chimiche, fisiche, e morfologiche. Il potenziale zeta, le dimensioni delle nanoparticelle e la capacità di imbibizione delle matrici verranno studiati parallelamente alla cinetica di rilascio delle nanoparticelle dallo scaffold ed alla capacità di condensazione del siRNA alle nanoparticelle. Il rilascio di siRNA, la stabilità del siRNA coniugato alle nanoparticelle quando posto in ambiente biologico e l’efficienza del “silenziamento” genico verranno studiati sui nuovi vettori nanostrutturati che saranno risultati biocompatibili (buona vitalità cellulare, nessun effetto immunotossico e genotossico). The rapid development of mammalian RNA interference (RNAi) opens the path to a powerful new strategy for therapeutic regulation of gene expression (McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet (2002) 3:737-747). Promising results have been attained with small interfering RNAs (siRNAs) in animal models and several clinical trials are underway (de Fougerolles A, Vornlocher HP, Maraganore J, Lieberman J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov (2007) 6:443-453). However, despite abundant promise, a number of problems and hurdles remain for oligonucleotide-based therapeutics. As a prelude, it is important to recall that oligonucleotides (a) do not permeate intact cell membranes to any significant degree via simple diffusion, primarily because of the hydrophobic nature of the membrane lipid bilayer, (b) have limited blood stability and (c) show non-specific immune stimulation. Perhaps, the most important issue concerns the effective delivery of siRNA oligonucleotides to their respective sites of action on cells present in the target tissue. In studies of cells in culture, delivery agents such as cationic lipids or polymers were used in order to attain significant siRNA effects. However, the large size and/or considerable toxicity of cationic lipid particles and cationic polymers as well as their peculiar pharmacokinetics may render them problematic candidates for in vivo utilization (Akhtar S, Benter I. Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNA-mediated gene silencing activity and specificity. Adv. Drug Deliv. Rev (2007) 59:164-182). For this reason, many investigators believe that development of appropriate local delivery platforms could be very helpful for oligonucleotide-based therapeutics, specially in diseases such as cancer. The combination of siRNA therapy and engineered scaffold represents a promising approach, with the scaffold providing the physical support for firstly entrapping the oligonucleotides and then releasing them to target cells in a controlled way. In this study we propose chemically based approaches to local oligonucleotide delivery, using innovative siRNA-nanoparticles conjugates entrapped in a biodegradable artificial matrix, so as to allow for their controlled delivery to and retention at treatment sites. Polymeric nanoparticles will be obtained by cross-linking the cytotoxic high molecular weight cationic polymer polyethyleneimine(HMW PEI) with modified polycaprolactone (PCL) or modified polyethylene glycol (PEG). In such a way, the high transfection efficiency of HMW PEI should be preserved, while its cell toxicity decreased. In addition, for formulating targetable siRNA/nanoparticles we carried out a novel synthesis of galactosylated PEG (hydrophilic polymer) by mutant beta-glycosidase from Sulfolobus solfataricus. The addition of specific molecules such as galactose will allow siRNA/nanoparticles to cell internalization via asialoglycoprotein receptors. To allow a local delivery of siRNA/nanoparticle conjugates without multiple injections, the conjugates will be entrapped in biodegradable scaffolds. Semi-interpenetrating polymer networks (SIPNs) composed of chitosan and alginate will be synthesized to obtain a bicompatible/biodegradable hydrogel scaffold. Alternatively, the creation of SIPNs composed of natural polymers and native, enzymatically degradable extracellular matrix (ECM) components (collagen, gelatin and/or hyaluronic acid (HA) is proposed. siRNA-nanoparticle conjugates will be entrapped in the hydrogels before their reticulation and are proposed as scaffolds for local siRNA/nanoparticles delivery. The new siRNA delivery platform will be characterized studying chemical, thermal and morphological properties. Particle size, zeta potential and swelling behaviour will be evaluated together with the release kinetics of the nanoparticles from the scaffolds and the siRNA condensation ability of the nanoparticles. The release of siRNA, the stability of siRNA nanoparticles in biological environment and the knockdown efficiency will be studied on the new formulated nanostructured vectors that evidenced biocompatibility (good cell viability, no immunotoxicity and no genotoxicity).